介绍

自然杀伤(NK)细胞可以在没有预先刺激的情况下杀死癌细胞，并且是用于癌症细胞治疗的有前途的工具(1, 2)。鉴于NK细胞仅占外周血单核细胞(PBMC)的一小部分，因此获得足够数量的NK细胞以满足临床需求，尤其是在计划多次输注时，具有挑战性。基于NK细胞的疗法将极大地受益于产生大量高细胞毒性NK细胞的可靠方法。

据报道，NK细胞可以在被细胞因子（例如白细胞介素(IL)-2）以及来自K562和HFWT（Wilms 肿瘤衍生细胞）等细胞系的蛋白质与NK细胞受体（例如NKG2D和 NKp46等(3-5)。淋巴细胞、单核细胞、脐带间充质细胞、Epstein-Barr病毒转化的淋巴母细胞、HFWT细胞、RPMI 8866 细胞和K562细胞已被用作饲养细胞，用于从PBMC扩增NK细胞 (6)。其中，K562人白血病细胞最常用作NK细胞扩增的饲养细胞 (5-7)。

最近，使用辐照基因工程K562细胞（例如具有膜结合IL-21 (mbIL21) 和K562细胞系的基于K562的人工抗原呈递细胞）的方案报道了显着的高细胞毒性NK细胞扩增率修饰以表达本研究中使用的膜结合 IL-15(mbIL15)和4-1BB配体 (K562-mb15-41BBL) (7-9)。

小鼠胚胎饲养细胞通常用于长期培养程序和胚胎干细胞的集落再生，并且通常被辐射和丝裂霉素灭活(10)。与这些小鼠胚胎饲养细胞一样，饲养细胞应使用丝裂霉素C进行辐照或有丝分裂灭活，以避免 K562细胞过度生长并确保没有活的K562细胞与扩增的NK细胞一起注入 (11)。

虽然辐照是更安全、更有效的方法，但有些研究所没有辐照器。此外，每次需要时对饲养细胞进行辐照是一个费力的过程。如果冷冻保存的辐照饲养细胞在合理的时间段内保持高水平的活力，则该过程将更容易且耗时更少(10)。然而，对于转基因饲养细胞K562-mb15-41BBL 饲养细胞的冷冻保存知之甚少，尤其是在γ辐射后。在本研究中，k8凯发(中国)比较了冷冻辐照和新鲜辐照的K562-mb15-41BBL细胞作为NK细胞扩增饲养细胞的能力。

试验结果

4-1BB配体和膜结合IL-15在新鲜和冷冻保存的K562-mb15-41BB饲养细胞上的表达。4-1BB 配体和膜结合IL-15在受照射的K562-mb15-41BB 细胞上的细胞表面表达通过流式细胞术检查并在新鲜和解冻冷冻保存的细胞之间进行比较。新鲜和冷冻保存的K562-mb15-41BB细胞具有相似的4-1BB表达水平；标记的新鲜细胞的平均荧光强度（MFI）为232.4±71.7，标记的冻存细胞的平均荧光强度（MFI）为231.7±2.8（p>0.05；图1A和B）。膜结合 IL-15 在冻融细胞 (MFI=36.6±2.3) 上的表达略低于新鲜细胞 (MFI=57.2±17.4, p>0.05;图 1C 和 D)。

NK 细胞扩增率和纯度。使用两个饲养细胞组，k8凯发(中国)比较了来自 7 个健康供体的 PBMC 的 NK 细胞的纯度和扩增率。在第 14 天（94.1±2.4 对 92.5±2.3%，p=0.018）和第 21 天（97.1±1.9 对 95.4±2.6%， p=0.018；图 2A)。两个组的 NK 细胞在三周内迅速增殖，新鲜组和冷冻组之间的 NK 细胞扩增率没有显着差异（图 2B）。

扩增的NK细胞对各种癌细胞系的细胞毒性。k8凯发(中国)检查了来自三个健康供体的扩增 NK 细胞对不同癌细胞系（如 K562、RPMI-8226、Raji、HL-60、SH-SY5Y、IMR-32、MG-63、Saos-2、和 ES8。在 4:1、2:1 或 1:1 的 E:T 比率下，在新鲜和冷冻保存的饲养细胞组之间没有观察到细胞毒性的显着差异（p>0.05；图 3）。

扩增的NK细胞上受体的表达。通过流式细胞术研究了 NK 细胞标志物 CD16、NKG2D、CD69、NKp30、NKp44、NKp46 和 CD158b 在第14 天从新鲜和冷冻保存组获得的扩增 NK 细胞上的表达。尽管供体之间存在轻微差异，但就表达特定受体的细胞百分比和分析的每种受体的相对表达而言，两组之间 NK 细胞标记物的表达相似（图 4）。

图2 体外扩增的人类自然杀伤(NK)细胞与新鲜K562-mb15-41BBL饲养细胞和冷冻保存的 K562-mb15-41BBL饲养细胞共培养的纯度和倍数扩增。A：NK细胞的平均倍数扩增。新鲜组与冷冻保存组NK细胞的倍数扩增率没有显着差异 (p>0.05) B：扩增NK细胞的纯度通过流式细胞术测定，使用荧光素异硫氰酸酯偶联抗体抗人CD3和藻红蛋白-CY5偶联的人CD56抗体。 新鲜组与冷冻保存组的平均NK细胞纯度在第0天和第 7天没有显着差异，但在第14天和第21天（p=0.018）。

扩增的NK细胞产生IFN-γ。评估了来自三个健康供体的扩增NK细胞响应K562细胞而分泌的IFN-γ量。用新鲜饲养细胞获得的NK细胞与用冷冻保存的饲养细胞获得的NK细胞之间的IFN-γ水平没有显着差异（分别为 644.5±91.4 与 652.1±85.2 pg/ml；p>0.05；图 5）。

新鲜和冷冻保存的辐照 K562-mb15-41BBL饲养细胞的存活率及其在扩增 NK 细胞中的频率。为了研究辐射对两组饲养细胞的生物学效应，将新鲜和冷冻保存的辐照K562-mb15-41BBL细胞在不含PBMC的完全 RPMI-1640培养基中培养10天。通过流式细胞术鉴定了第0、3、7 和 10天的活性异硫氰酸荧光素(FITC) 阳性 K562 mb15-41BBL细胞。如图6A和6C所示，新鲜辐照和冷冻保存辐照的细胞均未增殖，在培养的第 7天分别仅5.18±0.12% 和5.33±0.67%存活。在完全RPMI-1640培养基中，新鲜和冷冻保存的辐照饲养细胞的存活率没有显着差异。

比较两组受照射饲养细胞的存活率及其在NK细胞扩增过程中的频率。在新鲜和冷冻保存组之间的NK细胞扩增期间，在培养第0、3、7 和10天，FITC阳性饲养细胞的频率没有观察到显着差异（图 6B）。此外，新鲜组中只有4.76±4.05%、1.11±1.92%的FITC阳性饲养细胞和冷冻保存组中分别只有4.10±2.76%和0%在培养的第3天和第7天存活（图6D）。

为了确定扩增NK细胞是否可以杀死K562-mb15-41BBL饲养细胞，将两种扩增NK细胞组中辐照饲养细胞的存活率与完全RPMI-1640培养基中辐照饲养细胞的存活率进行比较。扩增的NK细胞中FITC阳性饲养细胞的存活率显着低于完全RPMI-1640培养基组（培养第3天时为 3.0±3.2% 对 80.4±3.5%，p=0.028；0.6±1.4%对分别为 5.3±0.4%，在培养第7天，p=0.028）。

讨论

检查了冷冻保存对 K562细胞上基因工程分子表达的影响。4-1BBL 在K562-mb15-41BBL细胞上的表面表达未因冷冻保存而改变，而与新鲜细胞相比，在冷冻保存的K562-mb15-41BBL饲养细胞上膜结合IL-15的表达略低。然而，在冷冻保存和新鲜照射的饲养细胞之间没有观察到统计学上的显着差异，这表明饲养细胞中基因工程分子的表达不受冷冻保存的严重影响。

比较了冷冻保存和新鲜照射的K562-mb15-41BBL细胞作为NK细胞扩增饲养细胞的能力。尽管在第14天和第21天，新鲜饲养细胞扩增NK细胞的纯度略高于冷冻保存细胞，但新鲜和冷冻保存组在NK细胞扩增率、对各种恶性细胞系的细胞毒性、NK细胞受体（CD16、NKG2D、CD69、NKp30、NKp44、NKp46和CD158b）的表达和IFN-γ分泌水平。

图 3 使用新鲜K562-mb15-41BBL饲养细胞和冷冻保存的K562-mb15-41BBL饲养细胞扩增的自然杀伤 (NK) 细胞的细胞毒性。扩增的 NK 细胞对K562的细胞毒性(A)RPMI-8226, (B)ES8, (C)RAJI, (D) HL-60, (E)SH-SY5Y, (F)IMR-32, (G)MG -63、(H) Saos-2 和 (I) ES8 细胞系使用基于流式细胞术的方法以 4:1、2:1 和 1:1 的效应细胞：靶标比率进行测量。显示的结果是来自三个供体的样品的平均值±SD。

图4 使用新鲜K562-mb15-41BBL饲养细胞和冷冻保存的K562-mb15-41BBL饲养细胞扩增自然杀伤 (NK) 细胞表面受体的表达。针对人CD16 (A)、自然杀伤组2、KG2D (B)、CD69(C)、NKp30 (D)、NKp44(E)、NKp46 (F) 和 CD158b (G) 抗体用于在第 14 天分析 NK 细胞受体。

在本研究中，对恶性尤文肉瘤细胞系和神经母细胞瘤细胞系的细胞毒性相当高；然而，骨肉瘤细胞系不太敏感，如图3所示。目前的发现似乎与之前的报告一致(11)。在 E:T 比例为 4:1、2:1 或 1:1 的所有测试细胞系中，新鲜组和冷冻保存组之间的细胞毒性未发现显着差异。

在本研究中，K562-mb15-41BBL细胞被冷冻保存在90% FBS中，10% DMSO作为冷冻保护剂。

有两种传统的慢速冷冻方法：控制速度冷冻 (CRF)，它使用速度控制的冷冻机，以及不控制速度冷冻(URF)，它使用被动冷却装置，例如填充有异丙醇的小型低温容器。在本研究中，使用更简单、省时且成本较低的URF方法来冷冻保存K562-mb15-41BBL细胞。

图 5 扩增的NK细胞响应K562白血病细胞分泌的干扰素(IFN)-γ 水平。在24h时收集无细胞培养上清液，并通过ELISA分析IFN-γ含量。

图 6 新鲜和冷冻保存的辐射K562-mb15-41BBL饲养细胞的存活率及其在扩增的自然杀伤 (NK) 细胞中的频率。A 和 C：通过流式细胞术分析K562-mb15-41BBL细胞的存活率。新鲜和冷冻保存的辐照饲养细胞在培养后没有增殖。B：扩增NK细胞中的K562-mb15-41BBL细胞门控是通过单独对K562-mb15-41BBL异硫氰酸荧光素 (FITC) 阳性细胞进行门控来建立的。实验是使用新鲜的K562-mb15-41BBL和冷冻保存的K562-mb15-41BBL饲养细胞在NK细胞培养的第 0、3、7 和10天进行 K562-mb15-41BBL 细胞门控。在扩增的NK细胞组之间，FITC 阳性饲养细胞的频率没有观察到显着差异。D：比较两个扩增的NK细胞组中 FITC 阳性饲养细胞的存活率。不到 5% 的FITC阳性饲养细胞在NK细胞扩增的第 3天存活。实验是在来自三个供体的细胞上进行的，所有样品都一式三份进行测试。显示了代表性结果。

含有K562-mb15-41BBL饲养细胞的冷冻管在液氮罐中冷冻保存长达四个月。就扩增的NK细胞的数量和功能而言，新鲜和冷冻保存的细胞之间没有发现差异。可能需要进一步调查以确定较长时间（例如一年）的K562-mb15-41BBL饲养细胞冷冻保存是否会影响来自人PBMC的NK细胞的扩增。

小鼠胚胎饲养细胞通常用于胚胎干细胞的长期培养程序和集落再生，并且通常被辐射和丝裂霉素灭活(10)。与这些小鼠胚胎饲养细胞类似，饲养细胞应使用丝裂霉素C进行辐照或有丝分裂灭活，以避免 K562细胞过度生长并确保没有活的K562细胞与扩增的NK细胞一起注入 (11)。为避免饲养细胞过度生长，它们以30-100 Gy (5, 23-25) 的不同剂量进行辐照，这被认为是安全有效的。与使用 100 Gy 辐照 K562 饲养细胞的其他报告类似 (7)，在本研究中，100 Gy辐射用于饲养细胞处理。比较辐照对两组K562-mb15-41BBL饲养细胞的生物学效应。正如预期的那样，新鲜和冷冻保存的辐照细胞都没有增殖，在培养的第7天分别只有5.18±0.12%和5.33±0.67%存活。

为了研究扩增NK细胞是否可以杀死K562-mb15-41BBL细胞，比较了NK细胞扩增过程中细胞与仅维持在完全培养基中的细胞之间受照射饲养细胞的存活率。在第3天培养时，FITC阳性K562-mb15-41BBL饲养细胞在扩增NK细胞中的存活率显着低于完全RPMI-1640培养基中的饲养细胞（分别为 3.0±3.2%和80.4±3.5%；p=0.028）。正如预期的那样，扩增NK细胞本身会杀死受辐射的K562-mb15-41BBL细胞，因为K562是对NK细胞最敏感的细胞系。

Lapteva等人设定的临床级NK细胞产品的放行标准(26)是NK产品中 FITC阳性细胞的<0.1% 频率。他们报告说，在培养的第10天，NK产品中FITC阳性细胞的频率为0.01-0.07%。在k8凯发(中国)的研究中，在培养的第10天，新鲜组(n=3)和冷冻保存组(n=3)扩增NK细胞中GFP阳性细胞的频率均为0%，这一发现满足了释放标准 <0.1%。这些结果在意料之中，因为转基因K562-mb15-41BBL细胞接受了100 Gy的辐射，并且非常容易被培养中增殖的NK细胞杀死。此外，这些结果是预料之中的，因为没有使用K562-mb15-41BBL细胞进行每周重复刺激，并且因为k8凯发(中国)的协议使用了非常低的辐射K562-mb15-41BBL细胞与PBMC的比率(0.08:1)，与其他协议；100-Gy照射的K562-mb15-41BBL细胞以K562-mb15-41BBL与NK细胞(26) 的10:1比例接种，以及100 Gy照射的基于K562的基因工程人工抗原呈递细胞与 mbIL21共同-与PBMC以2:1的比例培养 (7)。

尽管辐照是比丝裂霉素C治疗更安全、更有效的方法，但某些研究所没有辐照器，并且机器通常位于良好生产规范(GMP)设施之外，尽管研究所可能有辐照器。在这种情况下，在多个小瓶中使用冷冻保存的辐照饲养细胞比每次需要时辐照细胞更方便。此外，它还有助于控制GMP设施中的感染。

在本研究中，k8凯发(中国)表明，与新鲜辐照的饲养细胞相比，冷冻保存的辐照饲养细胞在1到4个月内保持了相似的功能。k8凯发(中国)的结果表明，冷冻保存的辐照饲养细胞可用于人类NK细胞的离体扩增，为现有方法提供了便利的改进，尤其是在没有γ辐照器的情况下。