在现代，免疫学、分子生物学和病毒学的根本进步以及细胞制造和基因工程的技术进步导致免疫细胞疗法的发展令人振奋，T 细胞疗法成为该治疗类别中最先进的疗法.肿瘤浸润性 T 细胞和 T 细胞的过继转移可表达识别肿瘤抗原的重组 T 细胞受体，在某些实体癌中介导了令人印象深刻的反应率，嵌合抗原受体修饰的 T 细胞在对所有标准药物耐药的 B 细胞恶性肿瘤中表现出令人印象深刻的反应，和病毒特异性细胞毒性 T 淋巴细胞 (CTL) 有效控制免疫功能低下宿主中的一些病毒感染（图 1）。这一成功使免疫细胞疗法从研究机构的小规模研究发展成为全球商业企业。免疫生物学和合成生物学的持续进步、临床规模基因工程和基因编辑技术的快速进步以及私营部门投资的融合，使免疫细胞疗法在未来几十年对人类健康产生更大的影响。从这个角度来看，k8凯发(中国)总结了癌症、传染病、自身免疫和其他疾病的免疫细胞疗法的现状和未来前景。

图 1. 用于治疗人类疾病的免疫细胞疗法

合成生物学和生物工程的最新进展扩大了免疫细胞疗法的适用性，包括癌症、感染、同种异体移植和自身免疫。CAR-T 或 NK 细胞、工程化TCR 和 TIL 疗法已经并将继续在血液学和实体癌中进行测试。正在开发 Tregs、CAR-Tregs 和CAAR-T 细胞来治疗各种自身免疫性疾病并防止移植组织的排斥反应。

---癌症的 T 细胞疗法---

肿瘤浸润淋巴细胞TIL的过继转移

1980 年代末和 1990 年代初进行的研究表明，25%–50% 的转移性恶性黑色素瘤患者接受了体外扩增的自体肿瘤浸润性 T 细胞（肿瘤浸润性淋巴细胞 [TILs]）加重组人白细胞介素的输注治疗-2 (rhIL-2) 经历了持久的完全缓解。这些令人印象深刻的结果是开创性的，因为它们为人类肿瘤特异性 T 细胞介导的免疫提供了无可辩驳的证据，并导致了作为 T 细胞识别癌症基础的自身抗原和新抗原的分子。

其他研究证明了淋巴细胞减少诱导的稳态细胞因子升高在支持过继转移的 T 细胞扩增方面的关键作用证明了淋巴细胞清除疗法是有效的过继 T 细胞治疗癌症方案的关键组成部分。

尽管 TIL 治疗在肿瘤学中的整体临床效果受到限制，部分原因是非黑色素瘤患者无法可靠地产生足够数量的生物活性 TIL，但在转移性结直肠癌或乳腺癌患者接受输注富含患者特异性新抗原的 TIL治疗后，也观察到了有希望的结果。

表达工程化TCR的T细胞

基因工程的进步使研究人员能够从应答患者的 TIL 中克隆肿瘤反应性 T 细胞受体 (TCR)，并在从其他癌症患者的外周血扩增的 T 细胞中表达 TCR，为治疗应用提供了潜在的无限数量的细胞（图 2）。尽管产生表达这种“工程化TCR”的 T 细胞在技术上是可行的，但将这种方法应用于临床的早期经验面临着一些挑战。

一个问题是转基因、肿瘤特异性 TCR α 和 β 链与内源性受体配对，这导致转基因 TCR 表达水平低和脱靶毒性风险。通过优化载体设计和加入半胱氨酸和/或鼠源元素进入转基因α 和 β 链以诱导转基因蛋白质的优先配对。

图 2. 免疫细胞疗法的连续性

非工程化免疫细胞疗法（左）还在各种疾病背景下表现出临床疗效，包括从患者单采分离的外周 Treg，这些 Treg 被扩增并重新注入患者体内以治疗自身免疫性疾病、GVHD 或器官排斥。肿瘤浸润淋巴细胞 (TIL) 从切除的肿瘤（通常来自黑色素瘤患者）中分离，体外扩增，并重新注入患者体内。储存的供体病毒特异性 CTL 被解冻、扩增并重新注入 HLA 匹配的受体中，用于治疗慢性感染。工程化免疫细胞疗法（右）是通过首先从患者身上提取或抽取血液，分离 T 细胞，然后使用病毒或非病毒方法插入编码合成受体的转基因来产生的。工程化 T 细胞的例子包括 (1) 表达由 TCR α 和β 亚基组成的工程化 TCR 的 T 细胞；(2) 表达CAR的T细胞（CAR-Ts）或NK细胞（CAR-NKs），由细胞外抗原结合结构域与参与TCR信号传导的细胞内结构域融合组成；(3) CAAR T细胞（CAAR-Ts），其中嵌合受体由靶向自身反应性B细胞的抗原结合结构域组成；(4) CAR-Tregs，其中 Tregs 从外周血中分离出来，并被设计成表达一种 CAR，将它们重定向到受自身免疫性疾病影响的组织。在重新注入患者体内之前，所有工程化的T 细胞类型都在体外进一步扩增。值得注意的是，经过修饰以表达 CAR 或 TCR 的 T 细胞主要包含细胞毒性效应物，因为目前的培养方法并未显着富集 Treg。

第二个挑战是确定 TIL 群体中包含的用于遗传转移的安全有效的 TCR。存在于黑色素瘤肿瘤中的很大一部分 TIL 可以识别在健康组织上低水平表达的自身抗原，强调了工程化TCR 引发显着的靶向、非肿瘤毒性的潜力（见表格1）。

与识别外来抗原的 TCR 相比，识别自身抗原的 TCR 通常表现出低效力，部分与胸腺选择导致的低亲和力有关。

为了提高 TCR 识别肿瘤相关自身抗原的效力，研究人员使用酵母或噬菌体展示或通过用人类抗原免疫小鼠来增强它们的亲和力。亲和力增强的肿瘤反应性 TCR 通常表现出增强的效力，但在临床试验中，由于识别正常组织上的低水平抗原，因此会增加靶内、肿瘤外毒性的风险。亲和力增强的 TCR 也容易发生交叉反应，正如一项研究中发生的两起死亡事件所示，其中 T 细胞被设计为表达靶向黑色素瘤抗原基因 (MAGE)-A3-的高亲和力 TCR HLA-A*01 背景下的衍生肽与心脏组织上表达的肌联蛋白发生交叉反应。在一个相关的例子中，设计用于靶向 MAGE-A3 的高亲和力 TCR 诱导了致命的神经毒性，可能是因为与脑组织中表达的 MAGE-12 衍生肽的交叉反应。

现在已经开发出预测工程化 TCR脱靶毒性的方法，一些高亲和力的 TCR 证明了安全性和显着的临床活性。最值得注意的是高亲和力 TCR (c259)，它识别源自 HLA-A2 上表达的 NY-ESO-1/LAGE-1 的肽。大约 50% 的患者接受了淋巴细胞清除准备方案，然后是 1-10×109 表达 c259 的 T 细胞，有或没有 rhIL-2，经历了持续的抗肿瘤作用。尽管有良好的反应率，但在大多数患者中并未观察到完全根除肿瘤，并且正在进行工作以更好地了解对这种疗法产生耐药性的基础。在自体造血干细胞移植 (HSCT) 后通过过继转移表达 c259 的 T 细胞治疗的表达 NY-ESO-1/LAGE 的多发性骨髓瘤患者中也观察到了良好的临床结果。类似地，表达靶向肿瘤相关抗原 WT-1 的工程化 TCR 的 T 细胞表现出良好的安全性，并在 HSCT 后施用时在预防急性髓性白血病复发方面显示出令人印象深刻的结果。

为了克服与靶向肿瘤相关自身抗原相关的挑战，几个小组试图确定介导识别肿瘤特异性新抗原的 TCR。对新抗原的免疫反应似乎在免疫检查点抑制治疗后的抗肿瘤反应中发挥重要作用，并且识别新抗原的 TCR 不需要亲和力成熟，预计会显示出安全的特征。表达工程化患者特异性、新抗原靶向 T 细胞的自体 T 细胞已经小规模产生，但与这种个性化方法相关的成本可能无法大规模应用。克服这一挑战的一种策略是将开发重点放在针对共享新抗原的工程化 TCR 疗法上。已在常见癌基因中发现了几个反复出现的“热点”突变，例如磷脂酰肌醇 3-激酶 (PI3K)、Ras 和 p53，以及一些源自热点突变的肽在某些 HLA 等位基因上表达，如在结直肠癌中的 KRAS G12D 突变和脑肿瘤中的 H3K27M 突变中所观察到的。此外，人们对鉴定靶向致癌融合蛋白断点区域的 TCR 重新产生兴趣。有可能生成一个 TCR 库，识别在一系列 HLA 等位基因上表达的肽，并使用下一代测序和主要组织相容性复合体 (MHC) 分型来确定适合此类治疗的患者。然而，鉴定表现出效力和特异性的 TCR 以及与 HLA 类型和肿瘤热点突变相匹配的患者比例相对较小，这限制了该策略的广泛适用性。

工程化 TCR 疗法的未来发展之路

结合工程化 TCR 的 T 细胞治疗剂的持续进展将需要技术来提高效力、特异性和安全性。到目前为止，开发有效且安全的 TCR 所需的大量努力已将此类治疗药物的可用性限制在一小组等位基因，例如 HLA-A2，导致具有不太常见的 HLA 等位基因的患者获得治疗的重大障碍。该领域的进展正在进行中，包括最近修改 TCR可变域框架区的方法，该方法可提高表达水平并增强效力，同时限制交叉反应的风险，以及新的产生从头 TCR 的技术或识别肿瘤反应性 T 细胞的抗原靶点。此外，许多工程改进正在开发中，以提高过继转移的 T 细胞治疗癌症的效力（图 3），将这些改进整合到表达肿瘤反应性 TCR 的细胞中可以提高疗效。已经在临床试验中的例子包括一项测试 NY-ESO-1/LAGE-1 特异性 TCR T 细胞的试验，其中使用 CRISPR/Cas9 (NCT03399448)和使用免疫检查点抑制剂 (NCT02775292 和NCT03709706) 管理工程化 T 细胞的试验。

图 3. 增强过继性 T 细胞疗法的工程策略

复杂的生物工程方法正在开发中，以提高 T 细胞疗法的效力、特异性和安全性。正在开发自杀开关、门控和适配器 CAR 平台以减轻 CAR 介导的毒性。c-Jun 的异位表达或 NR4a 因子的基因缺失赋予 CAR T 细胞衰竭抵抗力，有可能提高实体瘤的疗效并增强持久性。CAR T 细胞还可以被设计为分泌特定因子以增强扩增或持久性（例如，IL-7、IL-12、IL-15 或 IL-21），减少对淋巴清除方案的需求，抵抗抑制性肿瘤微环境（例如，IL-18 的分泌，截短的转化生长因子 β [TGF-β] 受体的表达），或充当肿瘤特异性药物递送载体（例如，抗 PD-1 的局部分泌）。

用于 B 细胞恶性肿瘤的嵌合抗原受体 (CAR) T 细胞

CAR 将通常包含单链可变片段 (scFv) 的细胞外抗原靶向域与通常源自 TCR 的细胞内信号域相结合。表达 CAR 的 T 细胞不受 MHC 的限制，无论 HLA 类型如何，都能在患者中应用，并防止 MHC 下调引起的耐药性，这在癌症中很常见。现在可以很容易地获得技术来为基本上任何细胞表面分子（例如，修饰的蛋白质、脂质、糖和 MHC 限制性肽）生成 scFv 和其他结合剂，并设计具有广泛生化特性的结合剂。

包含 CD28 或 4-1BB 内域的 CAR T 细胞表现出显着的临床活性；然而，这些产品在扩张速度（CD28 扩张速度更快）、峰值扩张水平（CD28 扩张程度更高）和持久性倾向（4-1BB 表现出更大的持久性）方面有所不同。扩增动力学和持久性的差异与临床结果相关，因为 CD19.28.z-CAR 在淋巴瘤中表现出最高的反应率，CAR 介导的毒性较高，而 CD19.BB 中的 CAR 后复发似乎较低。用于 B-ALL 的 z-CAR，可能是因为CAR 持续至少 3-6 个月对于长期控制这种疾病很重要。这些观察结果强调了根据目标肿瘤的独特特征定制 CAR T 细胞构建体的潜在好处。虽然未经证实，但由于快速扩张动力学，更具侵袭性的肿瘤可能需要 CD28 共刺激，而那些进展较慢的肿瘤可以通过整合 4-1BB 共刺激的 CARs T 细胞更安全地控制。此外，可以优化 scFv 亲和力和/或 CAR 密度以靶向表达异质抗原水平的肿瘤或限制 CAR 介导的毒性（如下文更详细讨论）。

在接受表达 CD19 CAR 的 T 细胞治疗的患者中观察到显着毒性，包括细胞因子释放综合征 (CRS)，由此 CAR T 细胞抗肿瘤活性导致高水平的分泌性 IL-6、IL-1 和败血症样症状，以及与血脑屏障内皮细胞功能障碍有关的免疫效应细胞相关神经毒性综合征 (ICANS)由高炎症环境诱导。尽管这些毒性导致了严重甚至致命的并发症，但降低 CAR T 细胞剂量、使用类固醇疗法或阻断 IL-6R 的抗体（即托珠单抗）治疗一直非常有效。值得注意的是，大型多中心试验中的治疗相关死亡率目前低于 5%，这与针对这些难治性疾病的其他标准治疗方案没有什么不同。其他药理学策略，如抗 IL1 受体阻断或酪氨酸激酶抑制性达沙替尼，可有效且可逆地抑制 CAR T 细胞功能，已经在临床前模型中进行了测试，可以为标准CRS 管理疗法难治的患者提供现成的、美国食品和药物管理局 (FDA) 批准的替代方案。工程安全开关，例如诱导型半胱天冬酶 9，可以在严重毒性的情况下消耗 CAR T 细胞，但本质上是不可逆的，尚未经过临床测试.结合源自单纯疱疹病毒的胸苷激酶的替代自杀开关引发了免疫原性反应，导致过继转移的 T 细胞存活率降低，这说明外源蛋白工程化表达后免疫原性增强的潜在风险。

CD19 靶向 CAR 的临床成功获得了 FDA 和欧洲药品管理局的批准，并引发了学术界和私营部门对 CAR T 细胞研究的广泛投资，包括针对 B 细胞恶性肿瘤的其他靶点开发 CAR T 细胞。CD22 靶向CAR 在 ALL 患者中也表现出显着的成功，超过 80% 的患者在接受最高剂量水平治疗后达到完全缓解，而 B 细胞成熟抗原（BCMA）靶向 CAR 诱导 高比例的多发性骨髓瘤患者获得缓解。观察到的针对 B 细胞恶性肿瘤的 CAR T 细胞的高反应率是前所未有的，特别是考虑到大多数接受这些药物治疗的患者对所有其他疗法都无效。

用于非血液学实体瘤的 CAR T细胞 与在 B 细胞恶性肿瘤中观察到的成功形成鲜明对比的是，CART 细胞在实体瘤患者中没有表现出令人信服的活性证据。当前的概念认为，这可能代表了几个障碍的融合。一个主要挑战是缺乏在实体瘤上高水平、均一表达而在正常组织上表达有限的已鉴定细胞膜靶点。然而，随着研究人员更加专注于对癌症表面组进行编目，已经确定了具有显着差异表达的分子，包括腺癌上 MUC1 的 Tn 糖型、弥漫性内在性脑桥胶质瘤上的 GD2 神经节苷脂、神经母细胞瘤上的 GPC2和尤文肉瘤上的 PAPP-A。这些结果，再加上对 CAR 需要高水平抗原密度才能实现最佳激活的新认识以及该工程一，乐观地认为CAR T 细胞靶向实体瘤上过表达的细胞表面分子的治疗窗口可以被确定。

一个相关的问题是一般癌症，尤其是实体瘤上抗原表达的异质性，这激发了开发多特异性 CAR 的兴趣，如下所述（图 3）。细胞疗法对实体瘤的有效治疗也可能受到有限的贩运的阻碍。最近的工作表明，区域递送可以减轻 CNS 肿瘤和其他癌症（例如间皮瘤）的这一挑战，这些癌症主要表现出区域扩散。最后，众所周知，实体癌具有抑制性微环境，它通过多种途径抑制 CAR T 细胞功能，包括检查点受体配体（例如 PD-L1）的表达、缺氧和营养消耗以及抑制性免疫细胞（例如，调节性免疫细胞）。T 细胞 [Tregs]、髓源性抑制细胞 [MDSCs]）。如下所述，许多工程方法正在开发中，以应对这些挑战并增强 CAR T 细胞对实体瘤的效力（图 3）。

---传染病的 T 细胞疗法---

病毒特异性 T 细胞疗法

1990 年代初期的临床研究人员观察到，一些在异基因造血干细胞移植后白血病复发的患者在输注来自供体的 T 细胞后可能会缓解。这些数据最终为 T 细胞介导的抗白血病作用以及此类细胞治疗不受控制的病毒感染的潜力提供了令人信服的证据，这种情况在这种情况下并不少见。在严重免疫抑制的患者中，同种异体病毒特异性 CTL 对 EBV 感染和 EBV 相关淋巴瘤、巨细胞病毒、腺病毒、BK 病毒和人类疱疹病毒 6 感染的反应率非常高，移植的证据有限尽管使用了最低限度的 MHC 匹配产品。由于受体免疫功能不全，疗效取决于对同种异体细胞的有限排斥，而 GVHD 的缺失可能是由于缺乏幼稚 T 细胞的 CTL 产品的同种异体反应性有限。“现成的”病毒特异性 CTL 库现在可用于治疗涵盖绝大多数 HLA 等位基因的多种病毒，因此可能为大多数患者提供合适的产品（图 2)，私人投资正在寻求将这种疗法商业化。这些产品的成功也提高了使用病毒特异性 CTL 靶向病毒相关癌症的前景，包括由 EBV 驱动的癌症等。然而，由于病毒相关癌症患者保留了足够的免疫力来排斥同种异体细胞产物，这些努力主要集中在自体病毒特异性 CTL 或基因工程病毒反应性 TCR 的过继转移上，因此，与之前讨论的方法没有什么不同利用非病毒定向 T 细胞进行癌症治疗。

用于 HIV 感染的病毒特异性 CAR T 细胞

从 1998 年开始，针对 HIV 感染的 CAR T 细胞临床试验启动。T 细胞被设计为表达第一代 CAR，利用 CD4 外域识别 HIV Env 蛋白的 gp120 亚基作为其抗原结合域，从而能够识别 HIV 感染的细胞。这些试验并未证明在控制 HIV 感染方面有效，但由于抗逆转录病毒治疗药物的同时发展，许多患者表现出长期存活。值得注意的是，输注后 10 年以上测试的样本中有 98% 显示了持久性 CAR T 细胞的证据，没有证据表明载体在癌基因附近整合的细胞持续克隆扩增或富集，也没有证据表明存在持续性克隆扩增或细胞富集。任何有复制能力的逆转录病毒/慢病毒出现的证据。经过 500 多年的随访，这一经验是迄今为止最有力的证据，证明过继转移逆转录病毒工程 T 细胞是安全的，并且此类细胞或其后代能够持续存在十年以上。

正在进行许多努力以提高 HIV 特异性 CAR T 细胞的功效，其中许多与增强 CAR 对癌症的功能的努力重叠，包括增强 CAR T 细胞的持久性和工程化多- 克服病毒异质性的特异性。然而，一些挑战与用于 HIV 感染的 CAR 独特相关，包括需要在工程化 T 细胞本身中设计对病毒感染的抗性，研究人员正在尝试通过 CCR5 的基因编辑和干扰病毒机制的蛋白质的过度表达。由于与淋巴细胞清除方案相关的毒性在这种临床环境中不太可能被接受，并且由于 CAR 生物活性必须持续多年，因此工程细胞以确保长期持久性是一个主要焦点。在一个灵长类动物模型中，与从血液中产生的那些相比，由 HSC 产生的猿猴免疫缺陷病毒 (SIV) 反应性 CAR T 细胞在停止抗逆转录病毒治疗后表现出更强的持久性和对病毒血症反弹的保护，这提高了 HSC 衍生的表达 CAR 的 T 细胞的前景在这种情况下，细胞可能是首选。通过共同表达CXCR5，将 HIV 特异性 CAR T 细胞与淋巴组织 B 细胞滤泡中的 CD4+ T 滤泡辅助 (Tfh) 细胞共表达，靶向 HIV 潜伏库的工作也在进行中（图3）。

---自身免疫和其他疾病的 T 细胞疗法---

尽管在过去几十年中引入了用于自身免疫的改进治疗剂，但仍需取得更多进展。小分子酪氨酸激酶抑制剂和细胞因子靶向抗体显示出显着的临床疗效，但具有广泛的免疫抑制作用，不适用于全谱自身免疫性疾病。这些挑战促使人们努力开发更有针对性的方法，例如 Treg 的过继转移（图 2），这在保持自我耐受、维持免疫稳态和预防自身免疫方面发挥着重要作用。非工程化 Treg 的过继转移在各种自身免疫和 GVHD 的小鼠模型中产生了令人印象深刻的结果，以及在 GVHD、器官移植和 I 型糖尿病（T1D) 已被证明是安全可行的，并已证明在输注后长达 1 年的持久性（图 1）。然而，这些疗法的近期和长期疗效仍未得到证实。

CAR 正在 Treg 中表达，作为提高 Treg 疗法效力和特异性的策略。在一项具有里程碑意义的研究中，研究人员在结肠炎小鼠模型中设计了特异性针对 2,4,6-三硝基苯磺酸 (TNBS) 的 CAR Treg。CAR Tregs 以抗原特异性方式分泌抑制因子、增殖和改善疾病症状。在多发性硬化和移植排斥的小鼠模型中观察到类似的结果。CAR Tregs 在非工程化 Tregs 次优剂量下表现出治疗效果，提供证据表明 CAR 表达除了增强特异性之外还提高了 Treg 疗法的效力。总的来说，这些研究为 CAR Treg 疗法的临床测试提供了强有力的理论依据。

CAR Treg 疗法相对于效应 CAR T 细胞疗法的一个潜在优势是目标群体的维持，这可能导致目标组织中的 Treg 持续扩增、持久性和持久的免疫抑制。此外，尽管效应 CAR T 细胞疗法的脱靶毒性可能导致严重的组织损伤，但预计CAR Tregs 的脱靶效应不那么严重，可能包括对非患病组织的长期免疫抑制、机会性感染或抑制 局部肿瘤免疫。如果 Treg 表达一种表现出不依赖抗原的强直信号的 CAR，也可能出现类似的副作用，导致组成性和非特异性免疫抑制。

与 CAR Treg 相关的一个明显安全风险与 Treg 谱系的潜在可塑性有关。在 T1D 的小鼠模型中，原位暴露于炎症条件下的 Treg 失去了 FOXP3 的表达并转化为效应样 T 细胞。此外，包含 4-1BB 共刺激结构域的 CAR Treg 转化为缺乏免疫抑制能力的细胞毒性 CAR T 细胞，提高了将工程化 Treg 转化为效应细胞可以增强自身免疫而不是抑制自身免疫的前景 . 如果 CAR Treg 制造的产品中存在效应 CAR T 细胞污染，则可能会出现类似的现象。鉴于与 Tregs 相比，效应 T 细胞在激活时扩增得更快、更稳健，一小群效应 CAR T 细胞可以迅速胜过 CAR Tregs 并介导破坏性的自身免疫。

细胞工程和合成生物学为减轻此类毒性提供了潜在机会（图 3）。除了效应 CAR T 细胞中使用的药物诱导性自杀开关之外，一种在 FOXP3 表达缺失或响应炎性细胞因子转录时自主激活的细胞内在自杀开关可以帮助保护CARTreg 转换。或者，CARTregs 中 FOXP3 的异位表达可以通过维持 FOXP3表达和促进抑制功能来减轻转化。为了防止肿瘤免疫的长期免疫抑制或靶组织部位的机会性感染，可以采用可调平台，其中 CAR 活性取决于注入患者体内的蛋白质治疗剂 。在表现出突然和严重症状（即突发）时期的自身免疫性疾病中，如类风湿性关节炎或复发缓解型多发性硬化症，此类平台可以仅在这些时期诱导 CAR Treg 活性，同时在疾病症状出现时保持 CAR Treg 休眠最小。

最近，研究人员通过使用一种创造性的策略开发了嵌合自身抗体受体 (CAAR)，以利用效应 CAR T 细胞来治疗自身免疫性疾病（图 1）。CAARs 类似于典型的CARs，除了细胞外抗原结合结构域针对自反应 B 细胞的 B 细胞受体 (BCR)。研究人员利用了寻常型天疱疮的鼠类模型，其中靶向桥粒芯蛋白的自反应 B 细胞介导了皮肤损伤。表达具有桥粒芯蛋白 3 胞外域的 CAAR 的 T 细胞特异性靶向致病性 B 细胞，从而治愈。该研究提供了重要的概念证明，即 CAAR T 细胞可用于 B 细胞介导的自身免疫性疾病，其中特定的自身抗原是明确定义的，如类风湿性关节炎和红斑狼疮。

最近的一项具有挑战性的报告利用靶向成纤维细胞激活蛋白 (FAP) 的 CAR T 细胞来预防纤维化诱导的心肌病小鼠模型中的纤维化。在 4 周内诱导纤维化，并在诱导刺激后 1 周给予 CAR T 细胞。CAR T 细胞浸润心脏，诱导活性成纤维细胞被杀死，减少纤维化，从而改善心脏功能。在 12 周内未观察到明显的毒性，这可能反映了发炎心脏组织内成纤维细胞上表达的高水平 FAP 与正常组织中成纤维细胞上表达的低水平 FAP 之间的治疗窗口。在人类纤维化疾病的背景下是否可以确定这种时间依赖性和抗原依赖性治疗窗口仍有待观察，但这项研究证明了 CAR T 细胞治疗多种人类疾病的多功能性，肯定会成为一个领域 未来的研究。

---解决主要障碍的下一代工程---

基因工程、基因编辑、细胞重编程和合成生物学的进步提供了一个越来越强大的工具箱，可以用来设计解决目前限制该领域的耐药性和毒性问题的解决方案。这些解决方案中的许多都是模块化的，并且有可能以多种方式集成到单个细胞和细胞产品中，从而显着提高免疫细胞治疗剂的复杂性。

用单特异性 CAR T 细胞治疗后抗原阴性和抗原低逃逸

与肿瘤学或传染病（如结核病或艾滋病毒）中的其他靶向治疗类似，对任何一个靶标的选择性压力通常会导致逃逸变异的出现。毫不奇怪，抗原丢失代表了对 CAR T 细胞疗法的主要抗性形式。一个相关的问题是人们越来越认识到，与可以识别极低水平抗原的 TCR 治疗剂相比，最佳 CAR T 细胞激活需要高水平的抗原。尽管这种特性可以为靶向在正常组织中低表达的抗原（例如 GD2 神经节苷脂或间皮素）提供治疗窗口，但正如临床试验所观察到的，通过选择具有亚阈值水平的靶向抗原的变体，也可能发生对 CAR 疗法的抗性CD22-CAR 。为了解决这些问题，正在努力设计有效的多特异性 CAR T 细胞（下文讨论；图 3），通过改变 scFv 亲和力来调节 CAR T 细胞活化的抗原密度阈值、上调靶细胞上的抗原密度、靶向组织基质以防止变异肿瘤细胞逃逸，或工程方法来增强自然免疫的诱导，从而扩大 CAR 诱导的免疫反应以包括旁观者、抗原丢失变体。

赋予多重特异性以提高疗效（或门）

工程组合抗原识别可以通过克服抗原逃逸和/或增加可靶向抗原的库来提高 CAR T 细胞的功效（图 3）。施用多种 CAR T 细胞产品是多抗原靶向的一种策略。然而，这种方法显着增加了成本和劳动力。此外，在临床前模型中，这种方法不如将多特异性识别工程化到单个细胞中有效，并且在迄今为止唯一报告的临床试验中，反应率类似于接受单一 CAR T 细胞产品治疗的患者。正在开发几种方法来设计能够靶向两种抗原的单个细胞，其中任一抗原的结合都会触发 CAR T 细胞激活（布尔逻辑中的“OR”门）。一种方法是用编码两个 CAR 的载体共同转导单个 T 细胞群，而相关方法结合双顺反子载体以在每个细胞上表达两个单独的嵌合受体。

另一种方法是创建二价或“串联”构建体，其中通过 CAR 细胞外部分上的两个结合域中的任何一个识别抗原可以触发效应子功能。2016 年报道了一种用于治疗胶质母细胞瘤的 HER2/IL13Rα2 串联 CAR，并观察到对抗原逃逸的保护以及当两种抗原都存在时对 CAR T 细胞活化的协同作用。在临床前模型和临床模型中开发和研究了许多串联 CAR CD19/20 和 CD19/22 CAR 治疗淋巴瘤和CD19/22 CAR 治疗白血病的试验正在进行中。有趣的是，所有串联 CAR 设计都需要对各种配置进行系统测试，以确定每种抗原的最佳设计。例如，CD19/20CAR 需要测试特异性之间不同长度的接头，其中只有短接头保留功能，而最佳 CD19/22 CAR 需要一个环状结构，其中两个可变区CD19 成分散布在 CD22 结合成分的可变区中。

双靶点或多靶点 OR CAR 也可以使用所谓的“适配器”CAR 生成，该 CAR 具有可以结合多种不同抗原特异性的结合物的胞外域（图3）。必须使用可溶性适配器才能激活 CAR T 细胞，当同时使用多个结合剂时，可以实现 OR 门控。这种平台理论上提供了一个安全开关，因为 CAR T 细胞功能被可溶性适配器的清除所消融。调节 CAR 活性的能力不仅取决于 T 细胞扩增和持久性的动力学，还取决于赋予抗原特异性的衔接蛋白的半衰期和稳定性。另一种方法涉及改造 CAR T 细胞以分泌一种双特异性抗体样分子，该分子在一端触发 T 细胞活化，并在另一端结合肿瘤上的第二种抗原。这种方法最近在胶质母细胞瘤的背景下是首创的，其中针对致癌肿瘤抗原EGFR 变体 III 的 CAR T 细胞也分泌靶向 EGFR 的双特异性分子。

增强安全性的“AND”和“NOT”门控策略

CAR T 细胞也可以设计为仅在响应同时表达两种抗原的靶细胞时激活，从而能够区分表达抗原对的肿瘤细胞与仅表达一种靶标的健康组织（图 3）。在一种策略中，一种受体结合了 CD3 zeta 内结构域，而另一种结合了共刺激结构域。为了防止 OR 门，必须将包含 CD3 zeta 的 CAR 设计为具有非常低的亲和力，以便在抗原结合时仅诱导低于标准的激活。一种不同的方法涉及使用合成的 Notch (synNotch) 受体，其中synNotch 受体对抗原 1 的感应诱导对抗原 2 具有特异性的 CAR 转录。这种策略在解剖学上分离的实体瘤的临床前模型的背景下是有效的，其中一个表达两种抗原的肿瘤被移植到一侧，而仅表达一种抗原的第二个（对照）肿瘤被移植到第二侧。然而，在液体肿瘤模型中，表达抗原 1 (ROR1) 的正常基质与表达抗原 1 (ROR1) 和抗原 2（EpCAM 或 B7-H3）的肿瘤细胞在解剖学上混合在一起，synNotch 逻辑门未能幸免于难仅表达抗原 1 的健康细胞。一些研究人员还试图通过在 CAR 靶向抗原 2 上结合CTLA-4 或更有效的 PD1 的细胞内结构域来开发非门，其中抗原 1 仅在没有抗原 2 的情况下被靶向。这已被证明在成纤维细胞同种异体排斥的临床前模型中是有效的，但尚未进入临床试验。

针对 T 细胞耗竭和肿瘤微环境以增强效力

慢性抗原刺激导致 T 细胞耗竭状态，以功能障碍为特征；多种抑制性受体的表面表达，包括 PD-1、TIM-3 和 LAG-3 等；以及独特的转录和表观遗传谱有充分的临床前和临床证据表明 CAR T 细胞易耗竭，这限制了疗效。与表现出完全反应 (CR) 的患者相比，肿瘤浸润 CD19 CAR T 细胞的典型耗竭标志物在无反应者中更高，并且发现 CAR T 制造产品上的高耗竭标记物表达可预测无反应。由细胞膜中 CAR 受体的抗原非依赖性聚集或暴露于高肿瘤负荷引起的强直信号现象也可能导致精疲力竭。如果在工程化之前存在耗尽的 T 细胞，在基因操作之前选择具有更大增殖能力的 T 细胞亚群可以改善结果。有趣的是，临床前和临床研究表明，达沙替尼或依鲁替尼等小分子药物可以预防或逆转 T 细胞耗竭。最后，通过调节 CAR 蛋白对强直 CAR 信号的瞬时破坏可以表观遗传重编程耗尽的 CAR T 细胞并增强临床前模型的功效。

最近的一项案例研究报告了单个 T细胞克隆的富集，其中 CAR 转基因整合到 TET2 基因座中，导致功能丧失突变。这种突变赋予 CAR T 细胞更高的效力、扩增、持久性和类似记忆的表型，最终导致在报告时的 5 年完全缓解，提高了CAR T 的前景可以设计细胞来避免或抵抗衰竭（图 3）。这已成为该领域一个活跃和有前途的研究领域。CAR 转基因插入 TRAC 基因座和CAR 表达的内源性控制防止了临床前白血病模型的衰竭。转录因子 c-Jun 的过度表达已被证明可以保护 T 细胞免受最累人的 CAR 设计的影响。在鼠类模型中，核受体转录因子 NR4A1、NR4A2 和 NR4A3的表达也与 CAR T 细胞耗竭有关，但没有这些药物的可用抑制剂，尚不清楚如何将这种策略应用于人类 T 细胞，其中3 个单独的基因需要敲除。

许多改变肿瘤微环境或赋予 CART 细胞抗性的方法也在研究中。一些团队专注于通过工程化分泌抗 PD1 纳米抗体、基因编辑以完全删除 PD-1 蛋白或设计一种“开关”受体，由与 CD28 等共刺激分子的细胞内结构域融合的细胞外 PD-1 组成，可将肿瘤 PD-L1 诱导的抑制信号转化为激活信号。类似地，为了克服肿瘤过度表达 Fas 配体所施加的死亡信号，研究人员表达了一种显性失活 Fas 受体，该受体使靶向 CD19 的 CAR T 细胞的扩增和持久性增加。Brentjens 发表了一系列关于“装甲”CAR T 细胞的出版物，其中第二个转基因旨在改变肿瘤环境；这包括炎性细胞因子 IL-12或 IL-18或 CD40L的分泌，以增强抗原交叉呈递并促进表位扩散。其他小组也使用了转化生长因子 β(TGF-β) 受体的非信号形式，由于其组成型和高表达，该受体胜过内源性受体。该转基因首先应用于人类 EBV 特异性 T 细胞，然后作为第二个转基因包含在临床前模型和临床试验中靶向前列腺癌的人类 CAR T 细胞中(NCT03089203)。最后，临床前模型表明，靶向肿瘤基质和/或脉管系统可以增强 CAR-T 的功效并可能限制抗原阴性变异的逃逸。

替代免疫细胞（自然杀伤 [NK] 细胞、γ-δ [γδ] 细胞、NK T [NKT] 细胞和诱导多能干细胞 [iPSC] 衍生的免疫效应细胞）和同种异体免疫细胞疗法

尽管这篇综述主要集中在管理和改造αβ T 细胞的疗法上，但有一项新兴工作表明在使用类似技术来改造其他免疫效应细胞方面取得了进展，这些细胞可以赋予某些优势。NK、γδ T 细胞和 NKT 细胞的主要优点是它们都具有细胞毒性能力，但都不表达内源性 TCR；因此，当给予 MHC 不匹配的宿主时，它们不会介导 GVHD。然而，成人外周血 NK 细胞对逆转录病毒和慢病毒转导具有相对抗性，并且在缺乏高水平 IL-2 或 IL-15 的情况下表现出较差的持久性。为了避免这种情况，开创了一种方法，通过这种方法，包含在无关脐带血中的 NK 细胞被转导以表达 CD19 靶向CAR 和编码 IL-15 的转基因，其中最近的一份报告显示，接受这种疗法的 11 名患者中有 7 名介导了 CR。这种方法可以提供现成的 CAR-NK 细胞产品，从而实现 CAR-NK 治疗的前所未有的规模化。γδ T 细胞是外周血中的罕见群体，在离体培养过程中需要大量富集和双膦酸盐（Xiao 等，2018）。尽管如此，研究人员已经成功地用 CARs 转导了 γδ T 细胞，这些细胞在临床前模型中表现出活性。同样，不变的 NKT 细胞是非常罕见的群体，但在实体瘤中表现出临床前疗效，并且当它们被设计为分泌 IL-15 时显示出增强的持久性。

从 iPSC 生成免疫效应细胞的改进方法正在出现，进一步开启了工程化免疫细胞群可扩展性的潜力。目前尚不清楚 iPSC 衍生细胞与成熟 αβ T 细胞工程化的细胞产品相比如何表现出细胞毒性和持久性，以及是否可以使用人工细胞培养系统产生临床相关的细胞数量；然而，产生和提供有效的 iPSC 衍生的工程免疫效应细胞的成功方法为从取之不尽的来源制造数百剂治疗细胞提供了诱人的可能性。

这种方法成功的主要障碍是拒绝同种异体产品。不过，这方面正在取得进展。最近的初步报告已经证明了设计用于删除 TCR 和 CD52 的同种异体CAR T 细胞的可行性和一些临床活性，能够选择性地去除宿主中的淋巴细胞以使用 CD52 导向的 mAb 防止排斥。最近还报道了通过删除 HLA I 类和 II 类结合CD47 过表达来减少排斥的。如果可以克服 GVHD 和排斥的双重挑战，健康供体产生的免疫效应细胞库的可用性可以通过实现更具成本效益的疗法来改变免疫细胞疗法的领域，减少向患病者提供此类疗法所需的时间。患者，为更复杂的多工程提供平台，并实现跨产品的质量标准化，超出了使用自体平台所能完成的。

免疫细胞疗法是一类迅速崛起的治疗剂，FDA 批准了 CAR T 细胞疗法用于治疗 B 细胞恶性肿瘤，取得了显着进展，但事实证明，将其转化为实体瘤极具挑战性，而且这些治疗药物对其他疾病的影响有限。利用基因缺失、转录因子异位过表达、多特异性结合剂、布尔门控和其他合成系统的复杂生物工程方法将最终决定下一代免疫细胞疗法在多大程度上成为传统药物的有效替代品。