细胞和基因治疗(Cellular and Gene Therapy，CGT)领域正在迅速发展，在过去五年中开发细胞和基因疗法的数量大大增加。CGT的应用有望为患有各种疾病（从眼科疾病到癌症）的人们带来显着的治疗效果。

在细胞疗法中，来自供体（同种异体疗法）或来自患者（自体疗法）的细胞在体外增殖，然后引入患者体内。在基因治疗中，可以在体内或体外对体细胞的遗传物质进行修改。可以插入突变基因的功能拷贝，或者可以将与治疗方法相关的新蛋白质引入患者的基因组。例如，遗传性疾病可能涉及关键代谢酶基因的基因突变，导致酶底物在体内无功能和毒性积累。基因疗法将使用病毒载体或脂质纳米颗粒将功能基因引入体内。遗传修饰可以允许替代酶的生产，与需要定期给药外源性酶替代疗法的替代方法相比具有显着优势。目前的研究还为了开发对细胞内基因突变进行更精细的编辑（“基因编辑”）疗法。

与非病毒方法相比，用病毒载体转导宿主细胞具有相对较高的效率。然而，免疫原性和细胞毒性的挑战导致非病毒基因递送载体在体外和体内治疗过程中的使用增加。除了安全优势之外，非病毒方法还具有更容易制备、能够转移更大基因和显着提高转染效率的优势。正在探索非病毒基因修饰作为HIV、β-地中海贫血和其他疾病的潜在治疗方法。

案例：肿瘤学中的CGT

肿瘤学领域提供了CGT治疗的案例。从历史上看，癌症治疗基于手术、化疗和放射疗法。在过去的二十年里，靶向治疗——主要是单克隆抗体——已经成为许多癌症治疗的金标准。最近，通过利用患者的免疫系统来攻击肿瘤的免疫疗法已成为癌症治疗方案中的又一强大工具。再就是k8凯发(中国)今天所谈到的新兴免疫治疗方法，是基于细胞疗法的一种治疗手段。基于细胞的治疗可能涉及干细胞移植或过继免疫细胞疗法(adoptive cell therapy，ACT)，包括收集和使用患者自身的免疫细胞来治疗癌症。

自体疗法的优点包括低免疫原性和避免移植物抗宿主病。相反，主要缺点是细胞扩增所需的时间长度、供体起始材料的可变性以及个体化治疗规模化生产的后勤挑战。

尽管如此，诸如原材料短缺、侵入性检定方法、细胞异质性和纯度等挑战推动了对同种异体细胞和基因疗法替代品的寻找。为了应对这些挑战，正在出现用于创建适合同种异体方法的细胞治疗新方法。间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cell，MSC)源自诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSC)，与组织来源的细胞相比具有显着的改进。对于癌症疗法，科学家们正试图通过沉默介导宿主与移植物免疫反应的蛋白质，将自体嵌合抗原受体T细胞(Chimeric Antigen Receptor T-CellImmunotherapy，CAR-T)方法转变为同种异体疗法。有一些治疗例子是使用CAR-T细胞与沉默的T细胞受体或从T细胞转换为免疫原性较低的自然杀伤(NK)细胞。

由于其有针对性和个性化的特性，离体基因治疗通常具有更高的安全性。然而，细胞回收和体外操作可能是一个昂贵且复杂的过程。体内基因治疗可能更直接；但面临毒性或诱导免疫反应等挑战。临床上最常观察到的体内基因治疗毒性是肝毒性和细胞因子释放综合征(cytokine release syndrome，CRS)。此外，正在探索基因组编辑技术作为推进CAR科学工程的战略。与传统的CAR-T细胞相比，CRISPR/Cas9编辑的CAR-T细胞显示出增强的效力以及延迟的分化和衰竭。

为CGT设计合适的检测和分析方法

由于细胞和基因治疗产品采用独特的递送和治疗机制，必须开发非传统和全面的生物分析测试方法和策略来证明CGT的安全性和有效性。CGT的生物分析包必须能够确定治疗性蛋白质是否存在，并在作用部位起作用，有时是全身性的。由于许多基因疗法是通过载体（通常是病毒）传递的，因此也应监测抗载体抗体的存在和出现。还应特别考虑治疗性蛋白质的预先存在和紧急的免疫原性，特别是在经过大量预处理的患者人群中。此外，宿主免疫系统可能会将新表达的蛋白质识别为患者的外来蛋白质，并引发免疫反应。

检测治疗性蛋白质水平的方法

创建CGT的药代动力学(pharmacokinetics，PK)谱是一项复杂的工作。治疗性蛋白质药代动力学或暴露的生物分析策略不遵循用于传统小分子和大分子药物的正常药代动力学模型。例如，转基因的翻译产物可能仅在作用位点表达，因此生物分析策略必须能够在作用位点或全身检测表达的蛋白质，这取决于特定的治疗方法。此外，由于蛋白质是组成型表达的（基因表达不受时期、部位、环境影响，没有时空特异性），因此暴露不遵循典型的代谢阶段。相反，监测暴露的功能替代蛋白或酶的持续表达。吸附、分布和代谢也具有传统生物制剂和小分子的独特特征。

确定用于识别治疗性蛋白质水平变化的理想基质是生物分析程序的重要组成部分。这可能需要对多种基质（例如血清和脑脊液）中的表达蛋白进行监测，甚至可能需要从皮肤或肌肉等可及部位的活检中监测人体组织中的蛋白质水平。随着精准医疗的出现，这些手术也必须对相关患者进行微创，特别是在需要重复活检的情况下。对于导致酶表达的基因治疗，收集的基质中蛋白质的不稳定性可能需要对样品处理进行特殊考虑，包括在临床现场快速收集、减少冻融、向收集管中添加稳定赋形剂、最小化解冻时间和在冰上解冻。因此，与在患者血清样品中对抗体治疗剂进行更标准的药代动力学测试相比，在样品到达生物分析实验室之前对上游处理步骤的影响调查的重要性可能会增加。

在针对罕见疾病应用的基因疗法的情况下，入组患者可能几乎没有蛋白质表达，治疗后蛋白质可能高出许多数量级。这需要使用高度灵敏的方法，有时灵敏度可达pg/mL级，并且具有较宽的动态范围以充分表征患者对治疗的反应。蛋白质PK测定的首选方法是免疫测定。免疫分析设计简单，具有现成的试剂，并且可以轻松适应自动化以减少操作随时间的变化并实现高通量分析。免疫分析设计需要考虑抗体对是否可以正确区分可能存在的截短蛋白或其他无功能蛋白，酶联免疫吸附测定(ELISA)、中尺度发现电化学发光(MSD-ECL)和Luminex测定（该方法可以实现同时对细胞因子、趋化因子和生长因子等进行快速检测和定量分析）等方法都可用。在设计蛋白质PK方法以最大化灵敏度和动态范围时，可以评估超灵敏免疫分析平台。

许多基因疗法涉及到表达具有相似内源性对应物的蛋白质组分的剂量，这增加了蛋白质PK免疫分析设计的复杂性。内源性物质的存在会使分析设计复杂化：参考物必须在去除了内源性蛋白质的基质中制备，这是一个费力且可变的过程，或者参考物必须在缓冲液/分析稀释剂中制备。一种常见的策略是利用在缓冲液/分析稀释剂中制作的标准曲线与相应的重组蛋白，由自己生产或从商业来源获得。为了确认重组蛋白作为参考材料的适用性，建议进行特定的检测验证实验。检测设计策略还应确保所使用的捕获和检测抗体能够适当地检测重组蛋白和内源蛋白。应进行内源质量控制样品(QC)的精密度评估，以确保检测对重组和内源材料具有可接受的精密度。

为了评估重组和内源性材料的平行性，从健康个体的样品中制备内源性QC材料，并在多个稀释度下进行分析，以确定哪些稀释度反馈出一致的（稀释度之间）结果。当内源性蛋白水平与校准范围相比较低时，可以将校准物蛋白质添加到内源性QC检测中，以评估基质中校准曲线全定量范围的准确性。或者，可以通过向测定缓冲液中添加重组蛋白来制备QC样品，以评估校准曲线的准确性。在这种情况下，可以添加额外的内源QC样品来代表实际研究样品。

确定蛋白质的存在外，还必须在基因治疗应用的情况下评估蛋白质的功能。确定药物疗效的黄金标准是临床结果，但全面的生物分析包还应该含有治疗制剂的作用机制。在许多基因疗法的情况下，这是通过使用替代PK/PD（药效学）功能分析来实现的，例如酶活性分析或生物分析。当与蛋白质定量分析配对时，替代的功能分析也能提供信息，因为功能分析可能具有更大的分析变异性和更小的动态范围。这些因素会降低所产生数据的精度，并可能降低检测治疗组之间细微差异的能力。此外，与蛋白质水平相比，酶活性通常更容易在患者样品中不稳定。酶促检测可以使用与前面描述的内源性QC检测方法策略类似的方法进行验证，并且应该使用重组酶或内源性QC混合物来监测由于环境条件而导致的每日检测性能的潜在变化。

对于像CAR-T这样的细胞疗法，量化体内治疗细胞数量的选择包括流式细胞技术和定量聚合酶链反应(qPCR)。最近，数字PCR(dPCR),包括液滴数字PCR(ddPCR),已用于患者样本，以高灵敏度和精确度定量评估CAR-T水平。这些方法允许评估CAR-T疗法随时间的持久性。尽管dPCR和ddPCR报告绝对值并且不依赖于校准器或标准进行定量，但缺乏标准的CAR-T参考材料使基于细胞的治疗分析变得复杂。

使用基于qPCR和ddPCR技术的检测已成功用于监测CGT疗法中的生物分布和病毒脱落。这些检测允许检测和量化病毒在目标生物体或患者组织内的插入和整合，从而得出载体的拷贝数(copy number variation，VCN)，它是每个二倍体细胞内目标基因整合拷贝的平均数。这些整合有基因异常失活或不需要基因表达的风险。为了安全地监测研究中病毒的整合，整合位点分析(ISA)通常使用的方法通过下一代测序("Next-generation"sequencing technology，NGS)进行。ISA既可确认目标细胞或组织内目标基因的存在，又可识别整合的位置。总之，这些策略可以监测由慢病毒和AAV载体驱动的治疗剂的数量和位置。

评估安全性和免疫原性

检测引入或新表达的蛋白质或细胞只是CGT整个生物分析的一个组成部分。根据具体产品及其应用，安全性和免疫原性也需要作为临床生物分析的一部分进行评估。

对于CAR-T细胞疗法，基于生物标志物的方法对于监控安全风险很重要。例如，接受CAR-T细胞治疗的患者有患细胞因子释放综合征（cytokine Release Syndrome，CRS）的风险，这是一种免疫系统的过度反应。用检测C反应蛋白以及炎性细胞因子的分析可以监测CRS的发展。这些检测还可以确定CAR-T患者发生CRS的风险。

免疫原性评估对于CGT计划也必不可少。除了标准的抗药抗体(anti-drug antibody，ADA)免疫原性筛选之外，还必须在治疗开始之前和整个研究过程中表征针对载体和表达蛋白的预先存在的抗体。通常用于CGT的病毒载体是腺相关病毒(AAV)、腺病毒(AdV)和慢病毒(LV)。由于这些病毒在自然中广泛存在，必须在患者入组之前评估患者对病毒载体的免疫原性，以确保可以将治疗药物输送到目标部位并确保治疗效果。许多CGT研究将病毒载体免疫原性筛选作为其纳入筛选过程的一部分，因此可能会将具有高水平预先存在抗体的患者排除在研究之外，或者调整其剂量或补充空衣壳以确保靶向递送。例如，基于细胞的检测经常用于评估AAV递送载体的中和抗体的存在。在进行研究期间还必须监测病毒免疫原性，以确定不良事件或低疗效是否是由于紧急免疫原性造成的。

病毒免疫原性测定，监测B细胞介导的免疫原性，通常具有类似于ADA免疫原性测定的方法；它们通常是桥接或夹心免疫测定形式。设计病毒免疫原性测定的挑战包括试剂获取和病毒株交叉反应。试剂通常可以通过商业途径获得，但非标准病毒株和具有足够灵敏度和特异性的阳性对照抗体可能需要定制生产，因为它们可能难以获得。

此外，Nab检测需要带有报告基因插入物（即荧光素酶）的病毒载体。应该指出的是，转染效率低下会导致高度空衣壳和随后的报告基因表达不佳，会对基于AAV的Nab检测的精度和灵敏度产生严重的负面影响。申办者应在药物开发过程的早期调查试剂的可用性，并尽早开始签约或生产高质量的试剂。由环境暴露于相关病毒引起的人群中预先存在的AAV抗体的存在会使检测开发复杂化。这些并发症可能需要对阴性个体进行广泛的预筛选，以确定临界点和/或阴性对照池的制备。

CGT的第二个B细胞介导的免疫原性涉及针对表达蛋白的抗体。CGT试验中的患者可能会接受大量预处理，特别是在市场上有经批准的酶或蛋白质替代产品的情况下。需要在入组时和整个研究过程中评估免疫原性。预先存在抗体高发生率的人群可能需要替代统计策略来检测和表征治疗出现的免疫原性，例如确定治疗后ADA滴度的倍数变化。

蛋白质免疫原性的分析方法通常包括标准免疫分析桥接或夹心分析格式。方法开发的一些挑战包括获得足够数量的优质蛋白质储备、标记非抗体蛋白质和获得足够灵敏的阳性对照抗体。此外，蛋白质干扰和蛋白质结合配偶体干扰可能更难以在分析之外进行工程设计，因此可能需要采用非传统的解离或目标消耗方法，例如热处理或免疫沉淀样品处理。

ELISPOT（酶联免疫斑点）检测可监测T细胞免疫反应，检测特定细胞因子或抗原特异性抗体，以及低频率分泌细胞的频率，最好使用这种灵敏的检测技术进行检测。该测定可以在单细胞水平检测细胞因子或效应分子的分泌，并且比ELISA或细胞内染色技术更敏感。虽然它需要分离PBMC或其他细胞亚群，但它能够自动化，从而实现高通量筛选。这在基因治疗中变得有用，例如，当基于AAV的基因转移抗衣壳T细胞反应可以消除转导细胞并需要进行监测时。

流式细胞技术监测过继细胞疗法（例如CAR-T细胞）中注入细胞的细胞动力学。这对于评估体内抗原暴露后相关的扩增和注入细胞的持久性很重要。流式细胞术还可以对细胞治疗中经常监测的多种细胞类型进行免疫表型分析。一个这样的例子是T细胞淋巴细胞表型面板，它可以监测调节标记、激活、记忆或增殖。

在细胞疗法的情况下，免疫原性评估考虑ADAs，无论是预先存在的还是治疗后出现的，针对CAR-T细胞表面的关键表达蛋白。在设计生物分析方法时，研究团队必须决定CAR-T细胞上用于ADA开发的特定目标蛋白，并考虑是否将表达的、可溶性蛋白或细胞连接蛋白用于检测开发和验证。

概括

虽然CGT程序和其他大分子生物分析之间的分析类型存在许多共性，但细胞和基因疗法的独特特征需要关注各种生物分析挑战，包括分析灵敏度、动态范围、分析物稳定性、预先存在的抗体、内源性与重组材料、细胞产物和载体（病毒或LNP）异质性的性能，以及集成多个分析平台的需要。因此，对分析需求以及技术能力的早期评估对于确保生产出能够准确表征治疗产品的暴露、作用机制、功效和安全性的生物分析包非常重要。